噬菌体展示技术(phage display)是通过基因工程技术将外源编码多肽或蛋白质的基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达,随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面,可以保持相对的空间结构和生物活性。
噬菌体展示技术作为一种先进的抗体库构建技术能结合多种技术手段,于体外实现抗体的亲和成熟,并配合亲和筛选方法获得具有高亲和力的抗体。在噬菌体抗体展示技术中,VH和VL基因的随机重组,在一定程度上模拟了体内抗体亲和力成熟的过程。如果结合其它技术则可以使抗体的亲和力提高到一个更高的层次,下面介绍一些抗体亲和力成熟的方法。
噬菌体展示技术的优势
1. 方法简便快速、耗时少。从 mRNA 提取到抗体库构建,继而筛选出特异性抗体的阳性克隆仅需几周的时间。
2. 筛选容量大、效率高。噬菌体抗体库中通常含有 106-109 个不同抗原结合特异性的抗体分子克隆,可以对百万乃至亿万个分子进行选择,且每一轮「吸附-洗脱-扩增」可以使抗原特异性较强的克隆得到富集,非常容易从抗体库中筛选到特异性抗体。
3. 易于在基因水平操作,蛋白质表型与基因型统一。可以根据不同目的「随心所欲」地改造抗体结构、进行基因突变,制备各种新型抗体;另外,还可以将噬菌体抗体与一些功能性分子偶联形成免疫毒素、酶标抗体等,进一步拓宽了抗体的应用范围。
4. 易于规模化生产。
噬菌体展示技术流程
步骤1:构建噬菌体展示库
重组DNA技术用于将外来cDNA整合到病毒DNA中。不同的基因组被插入到多个噬菌体的基因组中。剪接到一个外壳蛋白的基因中,使该蛋白显示在噬菌体颗粒的外面,而这些分离的噬菌体只展示一种蛋白、肽或抗体。这些噬菌体的集合即为库,如抗体噬菌体库、蛋白质噬菌体库或随机噬菌体库。
步骤2:结合
这些库暴露于选定的目标,只有一些噬菌体会与目标相互作用。这些目标是计划识别特定的配体,如固定的蛋白、细胞表面蛋白或组织细胞表面蛋白。
步骤3:洗涤
未结合的噬菌体可以被洗涤缓冲液冲走,只留下那些对受体有亲和力的噬菌体。
步骤4:洗脱
洗脱缓冲液洗脱回收对目标有亲和力的噬菌体
步骤5:放大
展示特异性的洗脱噬菌体被用来感染新的宿主细胞进行扩增,或直接进行细菌感染和扩增回收的噬菌体。
噬菌体展示技术由于其广泛的应用领域备受关注,这就要求广大从业者在熟悉,掌握噬菌体展示技术的同时,广泛的开展交流与学习,不断地在应用噬菌体展示这一技术的同时取得新的突破。
噬菌体展示技术的应用
1.相对于传统的鼠免疫杂交瘤技术,采用人的天然噬菌体文库筛选出来的抗体是全人的,能够有效的降低免疫原性的风险,这个在需要长期定期注射给药的慢性病如类风湿疾病治疗中是十分关键的一个因素。
2.相对于转基因小鼠进行全人抗体的发现,需要体内免疫小鼠,一些人鼠同源性较高保守的蛋白,毒性较大的蛋白如针对炭疽毒素的上市抗体Raxibacumab,抗原不稳定的蛋白,有变构的蛋白以及多透膜的蛋白并不适用于体内筛选,人的噬菌体文库为体外筛选的模式能够进行更多靶点分子的抗体发现。而且噬菌体展示技术未经过体内免疫的过程,能够对单个靶点多表位(尤其是人鼠同源性较高的保守表位)的抗体发现。
3.相对基于免疫的体内抗体发现技术,动物免疫,后期的杂交瘤融合,单克隆筛选等繁琐细胞培养过程,噬菌体展示其淘选,筛选过程在大肠杆菌中进行,扩增过程非常简单,抗体发现的时间周期短,实验出现意外的风险低,试剂耗材和人力成本更低。
4.免疫后的动物能够抽取其B细胞进行免疫噬菌体文库的建立,综合体内免疫和噬菌体体外筛选的两方面优势。如第一个上市纳米抗体Caplacizumab是免疫羊驼然后利用噬菌体文库技术筛选出来的,此方法在科研用的工具抗体筛选和发现中有极大的作用。
5.对现有的抗体的基因序列进行随机或者定点突变构建突变文库,进行人源化或者亲和力成熟,筛选出亲和力更强的抗体或者条件激活抗体等,如Genetech的Ranibizumab和Bevacizuma上市抗体都是源于鼠克隆单抗体A4.6.1,Bevacizuma抗体的人源化是将CDR区移植到人的框架区(VLκ1, VHIII)然后经过定点突变得到的,而Ranibizumab的人源化是将CDR区域移植在不同的人的轻重链框架区构建噬菌体文库筛选得到的高亲和力抗体。
6.以现有的抗体为导标(Guided selection),利用天然噬菌体文库筛选出与该抗体作用于靶点一样表位的多个新序列抗体,能够取得和导标抗体体内药效一致的新序列抗体,如阿达木是以鼠单抗MAK195为导标,利用噬菌体展示,通过Guided selection筛选得到的。
7.挑选抗体轻重链框架区相对固定的组合构建CDR区多样的合成的噬菌体文库,轻重链框架区相对固定的组合移除了潜在的翻译后修饰位点(PTMs),使得筛选出来的抗体均有较好的理化特性,降低后期CMC的难度。如MorphoSys的Ylanthia合成噬菌体文库。
8.嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法的CAR通常是scFv,这个和噬菌体展示的scFv文库有相似的展示环境,利用噬菌体展示技术寻找CART中的CAR(嵌合抗原受体)是创新CAR-T疗法的关键。
9.噬菌体展示多肽的技术在药物研发领域也有十分广泛的应用。
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