拮抗内生细菌Bacillus mojavensis ZA1在马铃薯根内及根际的定殖动态及其对土壤微生物的影响
王 颖，杨成德*，薛 莉，崔月贞，杨小利
（甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，兰州 730070）
摘要：利用 GFP 标记和平板分离法研究了拮抗内生细菌 Bacillus mojavensis ZA1 在马铃薯根内及根际的定殖动态及其对土著微生物的影响。结果表明， 标记菌株 ZA1−gfp 在土壤中定殖数量为 3.7×104～7.3×104 cfu/g；马铃薯根际为 3.0×103～1.5×105 cfu/g，根内为 49～630 cfu/g；马铃薯的根部横切面、根毛和根表皮等部位均观察到发绿色荧光的菌株 ZA1−gfp 菌体或聚集菌落。利用灌根法施入生防菌后，土壤中细菌、放射菌数量显著增加（P＜0.05），土壤真菌数量在中期下降；土壤中细菌、真菌和放线菌的数量分别在相对稳定范围内（数据之间差异不显著）消长。该结果说明菌株 ZA1−gfp 能够在马铃薯根内及根际定殖且不影响土壤中土著微生物的群落稳定性。
关 键 词：拮抗内生细菌；GFP 标记；马铃薯；定殖动态；土壤微生物
有些拮抗内生细菌防治范围广，对细菌病害、真菌病害和线虫病害都有一定的作用，且对人畜及环境无毒，可长期稳定地定殖于植物体，通过自身产生的拮抗物质和酶类，与病原菌竞争营养物质和生态位，诱导寄主植物产生系统抗性及防卫信号来持续抑制病原菌的入侵和生长 [1]。因此，拮抗内生细菌作为一种生防资源，具有巨大的开发潜力，已成为近年来生防制剂研制开发的热点[2,3]。Liu 等[4]研究表明，Bacillussubtilis 对小麦全蚀病菌 Caeumannomyces graminis var. tritici 有较强抗性，其对小麦全蚀病的防治效果达55.3%；Gao 等[5]发现枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis Em7 是油菜茎腐病的有效生防因子，对其防治效果达到50%～70%；畅涛等[6]研究表明，内生细菌萎缩芽孢杆菌 Bacillus atrophaeus B-401 对马铃薯坏疽病的防效达 52.67%。早期对内生细菌的研究仅仅停留在对其发现、分离、分类、生物功能多样性及抑菌效果的直接描述等方面[7-10]，随着近年来的发展，人们逐渐开始在拮抗内生细菌的抑菌机制方面包括拮抗物质、诱导系统抗性以及与病原、植物的互作关系等方面展开研究，并取得了巨大的进步[11-13]。
理想的生防菌株除了广谱、高效，还必须能在寄主及其根围占据有利位点而稳定定殖，并且能在与土壤环境及其根际微生物区系的竞争中增殖存活较长时间[14]。内生细菌与根际细菌相比，具有更强的抵御生物和非生物胁迫的能力，因此更易于在寄主与土壤中定殖[15]。目前，用于研究微生物在植物体内定殖的常见方法有抗生素标记法、GFP 标记法、免疫学方法、电镜观察法、DNA 和 RNA 探针法、同位素示踪法和组织染色法等。其中，GFP 标记是基因标记技术中最常用的一种，GFP 标记系统的建立为研究微生物与寄主间的相互作用提供了更直观的途径，利用这种方法能够进行实时的、长期的、直接的检测，因而受到国内外研究者的重视。
菌株 ZA1 属于莫海威芽孢杆菌 Bacillus mojavensis，是一株分离自珠芽蓼的内生细菌，具有广谱抑菌特性，其对马铃薯坏疽病菌 Phoma foveata、炭疽病菌 Colletotrichum coccodes 和枯萎病菌 Fusariumavenaceum 等多种病原菌均有显著的抑菌效果，具备开发成为生物肥料与生物农药的基础条件和明显优势[16]。运用绿色荧光蛋白表达载体 pGFP78 转化 ZA1 后，成功得到表达 GFP 的标记菌株 ZA1−gfp。标记后菌株 ZA1−gfp 在荧光显微镜下呈现明亮的绿色，且功能稳定，菌株的抑菌能力及运动性等未受影响，为研究其在作物体内外的定殖及其开发微生物制剂奠定了基础。
因此，本试验研究标记菌株 ZA1−gfp 在马铃薯植株根际及根内的定殖动态，明确 ZA1 与马铃薯植株的互作关系；同时，研究标记菌株 ZA1−gfp 对土壤微生物的影响，旨在为评价 ZA1−gfp 对生态环境的影响提供科学依据，以期为马铃薯病害的生物防治提供理论依据，为菌株 ZA1 的商业化开发与应用奠定基础。
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